摘要：以发酵乳杆菌L. fermentumDF-4基因组DNA为模板，扩增目标片段。通过融合标签MBP提高重组表达的胆盐水解酶的可溶性，先后进行超声波破碎处理条件的优化，进一步进行亲和层析以获得分离纯化后的重组蛋白。纯化后的蛋白检测到胆盐水解酶活性。该实验为进一步研究胆盐水解酶的性质和降胆固醇机理奠定基础。
关键词：降胆固醇 胆盐水解酶 融合标签 表达优化
Abstract:Bile salt hydrolase gene was amplified by PCR using the gene from L. fermentumDF-4 as a template to amplify target fragments. Enhance a high solubility of bile salt hydrolase by integrating MBP Tag, and ultrasonic broken conditions were optimized for the production of bile salt hydrolase.Then the expressed protein were purified and isolated by further affinity chromatograpHy.Use the purified protein to detect in bile salt hydrolase activity. The study would lay a foundation for properties of bile salt hydrolase and high degradation of cholesterol.
Key word：assimilate cholesterol,bile salt hydrolase,fusion tags,optimizing expression
本课题结合标签融合技术，使重组蛋白可溶性增加并具有6×His片段，获得与金属二价离子结合的特异性，并通过细胞破碎、离心、亲和层析与浓缩的方式，将BSH酶从工程菌中提取纯化。探究了最佳超声波破碎的最佳条件，即菌体浓度为0.01g/mL，冰水浴超声破碎（5’’~10’’）×120。通过亲和层析获得了较纯的目标蛋白。但在亲和层析中也存在一些问题，比如在破碎过程中不使用loading buffer作为介质，会导致目标蛋白与层析介质的结合力不佳，更多的在上样后就流出。同时由于层析填料介质的不同，柱效也有明显的差异。应用GenScript Ni-NTA Resin亲和层析填料，所得酶量较少但可以获得较纯的BSH酶；使用美国伯乐公司的Ni-IDA填料，所得酶液BSH酶量较多但也含有一些杂条带。不同的缓冲体系也会对样品的洗脱效果产生影响。经过亲和层析纯化的样品中酶的含量较粗酶液降低，所以还要经过浓缩的步骤。
