摘要:目的：克隆宇佐美曲霉羧肽酶基因并将其在毕赤酵母中重组表达，测定重组酶的基本酶学性质。方法：以宇佐美曲霉Aspergillus, usamii E001总RNA为模板，通过RT-PCR扩增不含自身信号肽的羧肽酶基因PepF，将其克隆到pUCm-T载体上，经PCR和酶切鉴定后进行测序。以重组质粒pUCm-T-PepF为模板，通过PCR扩增PepF基因，构建毕赤酵母表达载体pPIC9K-PepF，电转酵母宿主菌GS115。采用Sephadex G-25 对发酵液进行初步分离纯化，收集活性部分，对重组羧肽酶进行酶学性质分析。结果：测序结果表明基因全长1440 bp，编码含479个氨基酸的成熟肽序列；重组菌在最佳发酵条件下获得的表达产物分子量为80,000 Da左右；茚三酮法测得酶活力最高可达57.15 nkat/mg；重组羧肽酶PepF作用的最适温度为45℃，最适pH为3.5。金属离子、EDTA等对重组酶的活性影响均较小，而丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对其抑制率达50%以上。结论：在毕赤酵母GS115中成功表达了具有较高酶活的宇佐美曲霉羧肽酶基因并测定其酶学性质，为进一步研究该重组酶的应用奠定了基础。
关键词：宇佐美曲霉；羧肽酶；克隆；表达；酶学性质
目录
摘要
ABSTRACT
第1章 绪论-1
1.1 立题背景-1
1.1.1 目的意义-1
1.1.2 羧肽酶的种类及其特点-1
1.1.3 国内外研究现状-2
1.2 羧肽酶的应用-3
1.2.1 医药工业应用-3
1.2.2 食品工业应用-4
1.2.3 蛋白序列测序-4
1.3 羧肽酶研究尚存在的主要问题-4
第2章 实验材料与方法-5
2.1 实验材料-5
2.1.1 菌株和质粒-5
2.1.2 工具酶-5
2.1.3 实验试剂-5
2.1.4 细胞培养基配制-5
2.1.5 实验仪器-6
2.2 实验方法-6
2.2.1 宇佐美曲霉的诱导培养-6
2.2.2 宇佐美曲霉羧肽酶总RNA的提取-6
2.2.3 茚三酮法测羧肽酶酶活-6
2.2.4 逆转录-7
2.2.5 PepF成熟肽基因合成-7
2.2.6 PepF基因与pUCm-T克隆载体的连接-7
2.2.7 JM109感受态细胞的制备和转化-8
2.2.8 克隆载体质粒pUCm-T-PepF的提取与鉴定-8
2.2.9 pUCm-T-PepF & pPIC9K质粒抽提-9
2.2.10 pUCm-T-PepF & pPIC9K EcoRI、NotI双酶切.-9
2.2.11 pUCm-T-PepF 、pPIC9K连接-9
2.2.12 SacⅠ单酶切pPIC9K-PepF质粒-10
2.2.13 线性化pPIC9K-PepF质粒回收-10
2.2.14 酵母感受态的制备-10
2.2.15 电击转化-11
2.2.16 转化子的鉴定与筛选-11
2.2.17 重组菌PCR验证-11
2.2.18 毕赤酵母中重组PepF的表达-11
2.2.19 摇瓶发酵条件的初步优化-11
2.2.20 重组蛋白的纯化-12
2.2.21 重组羧肽酶的酶学性质-12
第3章 实验结果与分析-15
3.1 PepF基因PCR扩增产物的鉴定-15
3.2 EcoR I、Not I双酶切pUCm-T-PepF-15
3.3 重组表达质粒pPIC9K-PepF的构建-15
3.4 重组毕赤酵母GS115/PepF的PCR鉴定-16
3.5 pPIC9K- PepF质粒通用引物验证-16
3.6 表达产物的SDS-PAGE鉴定-17
3.7 摇瓶发酵条件的初步优化-18
3.7.1 标准酪氨酸曲线-18
3.7.2 蛋白浓度标准曲线-18
3.7.3 发酵条件优化结果-18
3.8 重组羧肽酶酶学性质研究-19
3.8.1 最适pH值-19
3.8.2 最适温度-19
3.8.3 PMSF和EDTA对酶活性的影响-19
3.8.4 金属离子对酶活的影响-20
第4章 结论与展望-21
4.1 结论-21
4.2 不足之处及未来展望-21
参考文献-23
致 谢-25
