摘要: Klf4在细胞的增殖、分化、凋亡、胚胎的发育、肿瘤的命运决定等过程中发挥重要作用。
本实验设计时在klf4目的基因片段前加入了His标签和TAT标签，His标签用来蛋白的分离纯化，而TAT标签则对定向导入靶细胞起着重要作用。与此同时实验分别设计在大肠杆菌的胞内表达和周质空间表达体系，来探讨鼠klf4在大肠杆菌中活性的差别。
以klf4为模板，分别设计胞内及周质空间表达的引物，克隆出目的基因klf4。目的基因用Nco I 和 Xho I限制性内切酶进行双酶切，然后分别与用相同限制性内切酶酶切的PET28a及PET20b空载体在T4连接酶作用下连接，再转入大肠杆菌进行筛选，得到阳性重组子，构建胞内表达载体PET28a-klf4与周质空间表达载体PET20b-klf4。
成功构建的胞内与周质空间表达载体，转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株，对其表达产物进行鉴定，胞内表达主要以包涵体形式存在。之后上罐高密度发酵并以IPTG诱导表达，并对发酵全蛋白进行SDS-PAGE鉴定及目的蛋白的分离纯化。
关键词：Klf4；大肠杆菌；胞内；周质空间；表达；高密度发酵；纯化
目录
摘要
ABSTRACT
第1章 绪论-1
1.1立题背景及依据-1
1.1.1诱导性多能干细胞概述-1
1.1.2 Klf4转录因子-1
1.1.3大肠杆菌表达体系-1
1.2 本课题研究的主要内容-2
第2章 Klf4基因的克隆与胞内载体PET28a-Klf4的构建-3
2.1 载体构建说明-3
2.2 实验材料-3
2.2.1菌株和质粒-3
2.2.2培养基-3
2.2.3主要试剂及工具酶-3
2.2.4主要仪器-4
2.3 实验方法-5
2.3.1胞内PET28a-Klf4基因的扩增-5
2.3.2 PCR扩增的Klf4基因片段的胶回收-5
2.3.3 PCR扩增胶回收产物Klf4 Xho I/ Nco I双酶切-6
2.3.4 PCR产物纯化-6
2.3.5目的片段Klf4与胞内表达载体PET28a连接-6
2.3.6大肠感受态的制备及转化-6
2.3.7重组质粒pet28a-klf4的鉴定-7
2.3.8重组质粒测序鉴定-8
2.4实验结果与讨论-8
2.4.1 Klf4基因PCR扩增-8
2.4.2重组质粒PET28a-Klf4的构建-9
2.4.3重组质粒测序结果-10
2.4.4实验讨论-11
第3章 周质空间载体PET20b-Klf4构建-13
3.1 实验材料-13
3.1.1 菌株和质粒-13
3.1.2 培养基-13
3.1.3 主要试剂及工具酶-13
3.1.4主要仪器-13
3.2实验方法-13
3.2.1 周质空间PET20b-Klf4载体的构建-13
3.2.2 转化大肠杆菌感受态-14
3.2.3筛选阳性菌株及重组质粒PET20b-Klf4的鉴定-14
3.3实验结果-15
3.3.1表达载体PET20b-Klf4的构建-15
3.3.2 重组子菌液PCR验证.-16
3.3.3双酶切验证-16
3.3.4 实验讨论-16
第4章 重组载体的表达与高密度发酵-17
4.1 实验材料-17
4.1.1 菌株和质粒-17
4.1.2培养基-17
4.1.3试剂-17
4.1.4 实验仪器-17
4.2实验方法-18
4.2.1重组菌BL21(DE3)/PET28a-Klf4 , PET20b-Klf4的构建-18
4.2.2 目的蛋白初步鉴定-18
4.2.3重组野生菌Rosetta(DE3)/PET28a-Klf4的高密度发酵表达-19
4.2.4发酵液全蛋白SDS-PAGE电泳鉴定-19
4.3实验结果-20
4.3.1诱导前后的菌沉淀SDS-PAGE分析-20
4.3.2高密度发酵表达诱导前后产物SDS-PAGE分析鉴定-21
4.3.3实验讨论-22
第5章 目的蛋白的提取及纯化-23
5.1 实验材料-23
5.1.1高密度发酵液-23
5.1.2主要试剂-23
5.1.3 主要仪器-23
5.2 实验方法-24
5.2.1 蛋白的提取及变性-24
5.2.2 目的蛋白过镍柱纯化-24
5.2.3 目的蛋白疏水柱纯化-25
5.2.4 目的蛋白SP柱纯化-25
5.2.5纯化后蛋白透析复性-25
5.3 实验结果-26
5.3.1 镍柱纯化SDS-PAGE鉴定-26
5.3.1 疏水柱及SP柱纯化-27
5.3.1 梯度盐离子透析-27
5.4 实验讨论-27
第6章 结论与展望-29
6.1结果-29
6.2不足之处与未来展望-30
参考文献-31
致 谢-32
